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我們知道流式實(shí)驗(yàn)中抗體標(biāo)記的數(shù)量越多得到的信息就越詳細(xì)和準(zhǔn)確，以此同時(shí)，實(shí)驗(yàn)操作也變得更加復(fù)雜。多色流式實(shí)驗(yàn)中的補(bǔ)償操作，一直以來都是流式使用者非常關(guān)心的問題。甚至有人認(rèn)為，由于目前熒光染料的光譜普遍比較寬，可能會(huì)在相鄰的多個(gè)通道都造成比較大的干擾，因此很難在流式上完成超過18色以上的實(shí)驗(yàn)。事實(shí)是否真是這樣呢？恰巧哈佛醫(yī)學(xué)院附屬麻省總醫(yī)院的Dr. Ravi Mylvaganam與我們分享了他在6激光21色的CytoFLEX LX上做的一個(gè)多色實(shí)驗(yàn)。我們一起來看看。

Dr. Ravi Mylvaganam采用20個(gè)熒光抗體以及一個(gè)細(xì)胞死活染料組成21色的panel，可同時(shí)檢測多群記憶、效應(yīng)T細(xì)胞，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，NK細(xì)胞甚至是干細(xì)胞樣T細(xì)胞等細(xì)胞亞群，詳細(xì)的抗體和染料標(biāo)記如下所示：

實(shí)驗(yàn)樣本準(zhǔn)備步驟：
1. 標(biāo)記一個(gè)樣本管，在管中添加3 μL以下抗體：

• 1) CD3 BUV395

• 2) CD19 BUV496

• 3) CD56 BUV737

• 4) CD25 BV605

• 5) CD95 BV650

• 6) CD38 BV786

• 7) CD16 PerCP

• 8) CD4 PerCP-eFluor710

• 9) CCR4 PE-TexasRed

• 10) CCR7 PC7

• 11) CD8 AF790

2. 添加25 μL Brilliant Stain Buffer，渦旋混勻4秒；然后加入100 μL全血，再次渦旋混勻4秒后，在37oC下避光孵育20分鐘
3. 在試管中添加5 μL以下抗體：

• 1) CD57 Pacific Blue

• 2) CD45 Krome Orange

• 3) CD45 RA FITC

• 4) CCR6 PE

• 5) CD14 PC5

• 6) PD-1 (CD279) PC5.5

• 7) CD27 APC

• 8) CD127 APC-A700

• 9) CD28 APC-A750

4. 渦旋混合試管4秒后室溫避光孵育20分鐘
5. 在管中添加1 mL VersaLyse裂解液，渦旋混合2～3秒，室溫下避光孵育15分鐘
6 樣本200g離心5分鐘，棄去上清液
7. 在試管中添加5 μL IR Fixable染料，渦旋混合2～3秒，室溫下避光孵育20分鐘
8. 添加2 mL PBS重懸細(xì)胞，200g離心處理試管5分鐘，棄去上清液
9. 添加0.9 ml PBS和0.1 ml IOTest3固定液重懸細(xì)胞，可準(zhǔn)備上機(jī)檢測
10. 同時(shí)按照上述的孵育、離心操作制備單染管

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖可以看出，這個(gè)21色方案的結(jié)果分群清晰，不論是常規(guī)的CD3+CD4+Th細(xì)胞還是含量較低的Treg或者干細(xì)胞樣T細(xì)胞，都能很好的檢測到，看來對于CytoFLEX LX而言，21色實(shí)驗(yàn)也不是一個(gè)難題。如果您需要該方案詳細(xì)的信息，可與我們聯(lián)系。

多色補(bǔ)償問題的簡化，與流式細(xì)胞儀技術(shù)的發(fā)展密切相關(guān)。遙想小編當(dāng)年，那個(gè)流式細(xì)胞儀用完后還要用紅布蓋起來的年代，我剛開始接觸的是一臺(tái)4色的流式，當(dāng)時(shí)4色實(shí)驗(yàn)就是“多色”實(shí)驗(yàn)了！那時(shí)沒有離線補(bǔ)償也沒有自動(dòng)補(bǔ)償，流式也沒做得那么頻繁，調(diào)補(bǔ)償是相當(dāng)刺激的操作：先在17寸顯示屏上畫滿所有通道兩兩對應(yīng)的散點(diǎn)圖，上樣之后一定要眼疾手快反應(yīng)迅速默念“橫平豎直”，如果相關(guān)的門沒圈好，或者看到補(bǔ)償矩陣腦子蒙圈不知道調(diào)哪里，一著急就手足無措，經(jīng)常一管單染管跑完補(bǔ)償還沒調(diào)好所以實(shí)驗(yàn)前師兄師姐往往要提醒“單染管多準(zhǔn)備點(diǎn)樣本”……

現(xiàn)在儀器的補(bǔ)償操作相比以前，我的天，簡直不要好太多！

拿這個(gè)做21色方案的CytoFLEX LX舉個(gè)栗子：

首先，它可以自動(dòng)調(diào)補(bǔ)償，用戶只需要把單染管全跑一遍，圈好相應(yīng)的陰陽性細(xì)胞群，點(diǎn)擊計(jì)算補(bǔ)償就OK了，無論是2色還是21色都是這么簡單的操作。畫一堆圖看橫平豎直？不存在！

其次，它可以離線調(diào)補(bǔ)償。樣本比較多，想測完再拷回去慢慢分析？沒問題！

然后，CytoFLEX LX有補(bǔ)償庫功能，只要是做過的染料就可以把這個(gè)染料的補(bǔ)償信息存到庫里，以后做實(shí)驗(yàn)可以直接讀取，避免需要重復(fù)做單染管的煩惱。 最后，這個(gè)是壓軸的技能，方案里調(diào)好的補(bǔ)償會(huì)根據(jù)后續(xù)電壓的調(diào)整而自動(dòng)調(diào)整。也就是說，以后做完補(bǔ)償，跑樣本時(shí)發(fā)現(xiàn)某個(gè)通道的電壓如果再調(diào)一點(diǎn)就完美了，如果是以前或其他儀器，您需要調(diào)整電壓后再重新調(diào)補(bǔ)償，而現(xiàn)在在CytoFLEX LX 上，您直接調(diào)電壓就好了！

其實(shí)很簡單， 其實(shí)很自然，多色的補(bǔ)償并沒有那么難！雖然補(bǔ)償?shù)牟僮鞲悄芑?，但目前多色?shí)驗(yàn)中抗體和染料的選擇以及樣本的處理仍然是一門學(xué)問。如果您需要了解多色實(shí)驗(yàn)更多的信息，比如染料的搭配和選擇，以及樣本處理的方法，您也可以聯(lián)系貝克曼公司索取資料。

* CytoFLEX LX流式細(xì)胞儀僅用于科研，不用于臨床診斷。